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每年，約有280，000名患者接受機(jī)械或生物假體心臟瓣膜移植。20 雖然這些是救生設(shè)備，但這些假肢缺乏生長潛力是兒科患者的一個主要問題。他們必須經(jīng)歷多次分階段的干預(yù)，以適應(yīng)增加的環(huán)空尺寸，并增加發(fā)病率和死亡風(fēng)險。22 因此，迫切需要具有持續(xù)一生的生長能力的心臟瓣膜假體。3，21
去細(xì)胞化組織工程心臟瓣膜 （DTEHV） 可能是一種有前途的替代方案。從我們的第一個長期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們將DTEHV植入綿羊和非人類靈長類動物中，我們了解到DTEHV在5小時后開始重新填充，伴隨著植入8周后細(xì)胞外基質(zhì)的變化。此外，隨著時間的推移，ECM的產(chǎn)生表明組織再生和生長潛力。6，30 這與去細(xì)胞化的異源性心臟瓣膜相反，后者僅顯示有限的宿主細(xì)胞再填充。7，13 此外，這些DTEHV可以現(xiàn)成提供。5 雖然這些結(jié)果很有希望，但有小葉縮短和小葉與壁融合的跡象，最終導(dǎo)致瓣膜功能不全，其他組也報告了這種效果。8，10 關(guān)于這個傳單引信和縮短問題的解釋可以在閥門幾何形狀中找到。從Loerakker等人15的計算模擬中可以看出，當(dāng)在生理肺壓下加載時，這種原始瓣膜設(shè)計中的小葉在徑向方向上受到組織壓縮。這也許可以解釋為什么這種特殊的瓣膜幾何形狀與浸潤的宿主細(xì)胞誘導(dǎo)的重塑相結(jié)合，最終導(dǎo)致小葉尺寸減小。基于這些發(fā)現(xiàn)，Loerakker等人還提出了一種改進(jìn)的瓣膜幾何形狀，該幾何形狀應(yīng)該能夠在血液動力學(xué)加載期間徑向小葉延伸，以抵消細(xì)胞縮回力。這需要更深的腹部曲率，增強(qiáng)的凝固區(qū)域以及主要是圓周膠原取向。15 然而，迄今為止，在培養(yǎng)過程中控制組織工程心臟瓣膜（TEHV）的幾何形狀是有限的。無論支架起始基質(zhì)的初始形狀如何，組織壓實(shí)發(fā)生在所有可能的無約束方向上，以響應(yīng)用于培養(yǎng)瓣膜的血管衍生細(xì)胞（肌成纖維細(xì)胞）施加的牽引力。29 這導(dǎo)致小葉結(jié)構(gòu)扁平，培養(yǎng)后無共適配區(qū)。12，17
因此，本研究的目的是找到一種解決方案，以便能夠根據(jù)計算模擬中建議的幾何形狀改進(jìn)，施加和維護(hù)DTEHV幾何形狀，以減少肺負(fù)荷條件下徑向方向的小葉組織壓縮。開發(fā)了一種與改進(jìn)的幾何形狀相匹配的生物反應(yīng)器插入物，它將在培養(yǎng)過程中作為整體幾何約束。通過這種方式，小葉將在生物反應(yīng)器插入物周圍壓實(shí)自己，并且在去細(xì)胞化過程后移除插入物時，DTEHV很可能保持其形狀。這使得設(shè)計、施加和維護(hù)所需的 DTEHV 幾何形狀成為可能。生產(chǎn)了基于人類細(xì)胞的DTEHV，并使用流體動力學(xué)和疲勞體外測試評估了其功能和穩(wěn)定性。利用組織學(xué)和共聚焦顯微鏡研究了生物反應(yīng)器插入物對組織形成和膠原取向的影響。此外，通過力學(xué)性質(zhì)分析，研究組織各向異性程度，并作為計算模擬小葉組織負(fù)荷行為的輸入，以分析新設(shè)計的DTEHV中的徑向應(yīng)變分布。
根據(jù)Hamid等人的數(shù)學(xué)描述，原始閥門設(shè)計通過添加配合和增加腹部區(qū)域的曲率來改進(jìn)，如Loerakker等人先前所描述的那樣。15該改進(jìn)的幾何形狀被導(dǎo)出為STEP文件從模擬軟件（美國Abaqus 6.10 Simulia）中導(dǎo)出并導(dǎo)入到計算機(jī)輔助設(shè)計軟件中（Autodesk Inventor， 美國），以制造一個長度為27.8 mm，直徑為29.7 mm的一體式組件，該組件與舒張壓脈沖復(fù)印機(jī)（DPD）生物反應(yīng)器系統(tǒng)兼容。17 生物反應(yīng)器嵌件由一塊固體聚醚醚酮（PEEK）利用計算機(jī)控制的碾磨技術(shù)制成。
插入物位于瓣膜的動脈側(cè)，以便在各個柱子周圍進(jìn)行組織壓實(shí)。小孔（直徑0.5毫米，間距1毫米）覆蓋插入壁，以促進(jìn)與相鄰組織的營養(yǎng)交換。頂部有三個大的三角形開口，用于向組織工程瓣膜壁進(jìn)行介質(zhì)交換。
如前所述，組織工程心臟瓣膜（TEHV）（n = 5）進(jìn)行培養(yǎng)。17 簡而言之，從無紡布聚乙醇酸網(wǎng)（PGA，厚度1.0毫米，比重70毫克/厘米）切割三葉心臟瓣膜3;塞隆，盧森堡），縫制（Prolene 6-0，美國奧道康）到徑向自膨脹鎳鈦諾支架（長度= 31毫米，ID = 30毫米在37°C;PFM-AG，德國），并涂有1%聚-4-羥基丁酸酯（P4HB;分子量：1 × 106;美國四氫呋喃（THF;西格瑪-奧爾德里奇，美國）。心臟瓣膜形狀結(jié)構(gòu)的初始坐嬈長度為5 mm，最大橈骨腹部長度為19 mm。將這些構(gòu)建體用70%乙醇（EtOH，VWR國際S.A.S.法國豐特奈蘇布瓦）滅菌15分鐘，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌3次10分鐘，在抗菌抗真菌溶液中孵育10%青霉素/鏈霉素（Pen/Strep）（比利時龍沙），用0.5%真菌（美國InvivoGen）洗滌30分鐘，并用PBS洗滌3次10分鐘。此后，將閥門在生長培養(yǎng)基（美國吉布科高級杜貝克科的改性鷹培養(yǎng)基）中孵育過夜，并輔以10%胎牛血清（FBS，德國生物染色），1%筆/鏈球菌和1%谷氨酶（美國吉布科）。根據(jù)荷蘭二次使用材料的指南，從一名77歲患者的人類大靜脈中收獲了主要分離的人血管來源的細(xì)胞，并接種（0.3×106細(xì)胞/厘米2，通道6）使用纖維蛋白作為細(xì)胞載體進(jìn)入瓣膜形支架。將種子構(gòu)建體與新開發(fā)的插入物一起放入DPD生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，該插入物含有補(bǔ)充L-抗壞血酸2-磷酸（0.25mg / mL，美國西格瑪）的生長培養(yǎng)基。脈動流以1 Hz施加到瓣膜的非屏蔽心室側(cè)。
使用雙軸拉伸試驗(yàn)機(jī)（生物測試儀，5 N稱重傳感器;cellscale，加拿大滑鐵盧）與 軟件 （V8.01， 細(xì)胞標(biāo)度） 結(jié)合使用。兩個方形樣品 （36 mm2每個）每個瓣膜分別從腹部區(qū)域?qū)ΨQ切割。使用電子卡尺在3個隨機(jī)位置測量樣品厚度并取平均值。將樣品在徑向和圓周方向上等雙向拉伸，應(yīng)變率高達(dá)20%，應(yīng)變率為每分鐘*。拉伸后，樣品以每分鐘*的應(yīng)變速率恢復(fù)到0%應(yīng)變，然后休息循環(huán)54秒。在測量最終應(yīng)力之前，用其中5個循環(huán)對樣品進(jìn)行預(yù)處理。在徑向和圓周方向上通過每個單獨(dú)的數(shù)據(jù)集擬合高階多項(xiàng)式曲線。組織的剛度由切向模量表示，并定義為在20%應(yīng)變下與擬合多項(xiàng)式曲線的切線。
為了分析DTEHV疲勞行為隨時間的變化，對閉合體積，泄漏量，心輸出量和有效孔面積進(jìn)行了線性回歸分析（Prism V6.0d，美國Graphpad），p<0.05的斜率顯著不為零。對時間點(diǎn)進(jìn)行平均，并用它們的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。
對于生物力學(xué)分析，每個閥門的樣品取平均值，并用其平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各向異性的存在被定義為在徑向和圓周方向上獲得的剛度之間的顯著差異（p < 0.05），使用成對的學(xué)生t檢驗(yàn)（Prism V6.0d，美國Graphpad）進(jìn)行分析。
計算仿真所建議的改進(jìn)的心臟瓣膜幾何形狀被成功轉(zhuǎn)化為物理剛性物體（圖1a），與*相同的幾何形狀相匹配。嵌件的表面是光滑的，孔均勻分布在整個表面上，以使足夠的營養(yǎng)物質(zhì)交換到支架上。各個柱子之間有足夠的空間來防止培養(yǎng)過程中傳單融合。插入物很好地安裝在DPD生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，而不會阻礙從心室側(cè)流向動脈側(cè)的脈動流（圖1b）。
生物反應(yīng)器插入物和具有代表性的DTEHV結(jié)果。開發(fā)的生物反應(yīng)器嵌件，用于在培養(yǎng)過程中施加和控制心臟瓣膜幾何形狀（a）。以綠色表示的嵌件位置示意圖，在生物反應(yīng)器設(shè)置內(nèi)，心臟瓣膜以紅色表示，鎳鈦諾支架為黑色，脈動介質(zhì)流動為藍(lán)色箭頭（b）。從頂部（c）和底部視圖（d）兩張使用插入物培養(yǎng)的基于人類細(xì)胞的DTEHV的代表性圖片，顯示大的共置區(qū)域和深刻的腹部曲率，與生物反應(yīng)器插入物的形狀相匹配。
全尺寸圖像在培養(yǎng)的4周內(nèi)，TEHV的小葉緊緊地壓實(shí)在嵌件周圍，以適應(yīng)施加的幾何形狀。去細(xì)胞化后，瓣膜保持其形狀，并且在取出插入物時看不到小葉縮回。配合區(qū)域的長度約為5 mm（圖1c），DLEV的腹部區(qū)域保持施加的曲率（圖1d）。組織均勻地分布在整個小葉中，沒有任何損傷或其他宏觀可檢測的不規(guī)則性。
在流體動力學(xué)試驗(yàn)裝置中，DTEHV（n = 4）經(jīng)受生理性肺病。一個閥門的代表性圖如圖2所示。總體而言，所有閥門都*打開（圖2 b-2d），并對稱關(guān)閉（圖2 e-2f）。在任何瓣膜中均未觀察到脫垂。
生理流體動力學(xué)肺體外試驗(yàn)結(jié)果。在1200萬次循環(huán)后，DTEHV經(jīng)受體外流體動力學(xué)生理肺搏動刺激的代表性結(jié)果顯示功能正常，如圖（a）所示。閥門*打開（b–d）并對稱地關(guān)閉（e，f）。
全尺寸圖像對于長期耐久性測定，閥門的打開和關(guān)閉行為設(shè)置為與流體動力學(xué)設(shè)置中觀察到的生理行為相當(dāng)。從進(jìn)行疲勞試驗(yàn)的DTEHV（n = 4）中，三個保持功能，長達(dá)約1200萬次循環(huán)，代表體內(nèi)隨訪時間16周。一個閥門在400萬次循環(huán)中發(fā)生故障，并且從一開始就無法在疲勞測試期間保持穩(wěn)定的壓力條件。隨著時間的推移，閥門的功能沒有下降，初始反流分?jǐn)?shù)為4.13±1.44%，包括關(guān)閉體積百分比為3.41±1.42%，泄漏體積百分比僅為0.73±0.08%（圖3a）。閥門保持了 2.37 ± 0.04 cm 的一致有效孔口面積2，隨著時間的推移，心輸出量維持在 4.80 ± 0.11 L/min（圖 3b）。功能喪失是突然的，在所有情況下都是傳單在其中一個委員會點(diǎn)破裂的結(jié)果。
DTEHV 在體外的長期功能行為。從開始（n = 4），300萬個周期（n = 4），600萬個周期（n = 3），900萬個周期（n = 2）和1200萬個周期（n = 2）后，反流分?jǐn)?shù)，心輸出量和有效孔面積的間隔測量，顯示反流隨時間沒有顯著增加（p < 0.05） （a）.此外，心輸出量和有效孔口面積也隨時間保持穩(wěn)定（b）。值表示為±標(biāo)準(zhǔn)差的平均值。
全尺寸圖像對所有DTEHV的樣本進(jìn)行了組織學(xué)檢查。圖4中的代表性照片表明，組織均勻地分布在整個小葉的厚度中。此外，沒有觀察到壞死或受損的組織。去細(xì)胞化過程成功地去除了所有細(xì)胞，如H&E染色所示，盡管組織中仍然存在支架殘留物（圖4a）。從MTC染色中可以看出，小葉主要由膠原蛋白組成（圖4b），在VvG染色中沒有彈性基質(zhì)形成的跡象（圖4c），否則黑色纖維會表明這一點(diǎn)。
斷續(xù)器的組織學(xué)。具有蘇木精和曙紅的DTEHV小葉染色部分的代表性圖像，顯示適當(dāng)?shù)娜ゼ?xì)胞化，相等的組織形成和支架殘留物的存在（a）。馬森三色主要顯示藍(lán)色（b）中描繪的膠原蛋白沉積，其中彈性范吉森表明結(jié)構(gòu)（c）內(nèi)沒有彈性基質(zhì)形成。
全尺寸圖像通過分析膠原整個支架染色，在5個DTEHV小葉的整個半部分上，在約200μm的深度內(nèi)可視化了全局膠原取向。Z方向上的代表性最大投影如圖5a所示。在這里，膠原蛋白在共適應(yīng)區(qū)域（圖5b）的圓周方向上清晰地對齊，并且更隨機(jī)地分布在腹部的底部區(qū)域（圖5c）。
膠原蛋白定位。通過心室側(cè)共聚焦顯微鏡觀察半個DTEHV小葉上膠原特異性全囊染色的代表性圖像，顯示膠原方向在凝固區(qū)域（b）的圓周方向上清晰對齊，并隨機(jī)分布到腹部底部（c）。黑點(diǎn)表示焦平面外的局部區(qū)域。
全尺寸圖像控制閥的平均拉伸曲線顯示，在20%應(yīng)變下，徑向方向的柯西應(yīng)力范圍在200-300 kPa和圓周方向的300-400 kPa之間（圖6a），指示組織各向異性。從所有閥門的平均等雙向拉伸試驗(yàn)來看，與徑向（p = 0.035）相比，圓周方向的切向模量顯著更高，分別為3.59±0.95和2.47±20%應(yīng)變時0.74 MPa（圖6b）。
四氫呋喃的機(jī)械性能。從對照組的相等雙軸拉伸試驗(yàn)中獲得的徑向和周向應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示柯西應(yīng)力范圍在200-400 kPa （a）之間。擬合曲線用作計算模擬 （a） 的材料參數(shù)。所有DTEHV的計算切向模量顯示，與徑向相比，圓周方向的組織剛度顯著增加（*p = 0.035）（b）。所有值都表示為±標(biāo)準(zhǔn)差的平均值。
全尺寸圖像對照組的實(shí)驗(yàn)拉伸數(shù)據(jù)擬合數(shù)值模型（圖6b），得到以下參數(shù)值：\（k_= 2 2. 0\;k_ = 7。5 0, \;} \;\西格瑪 = 6 7.5^{{{循環(huán) } .\）
在平均肺壓差為15 mmHg時，計算模擬顯示，原始設(shè)計在加載期間在整個小葉的徑向方向上受到小葉組織壓縮（圖7a）。與原始設(shè)計相比，這些DTEHV改進(jìn)的閥門設(shè)計顯示出徑向組織壓縮的顯著降低（圖7b）。圓周方向的應(yīng)變在兩種設(shè)計中都保持了可比性。此外，在改進(jìn)的設(shè)計中，本膠原各向異性對組織負(fù)荷的影響顯示，與*各向同性的膠原取向相比，橈骨組織壓縮沒有變化（圖7c）。
計算模擬。將DTEHV的材料參數(shù)實(shí)施到已建立的計算瓣膜模型中，以評估原始和改進(jìn)的瓣膜設(shè)計中徑向和周向的應(yīng)變，模擬15 mmHg的平均肺壓。在最初的瓣膜設(shè)計中，整個小葉組織在徑向（a）上被壓縮。改進(jìn)的閥門設(shè)計顯示腹部徑向壓縮（b）顯著降低，這主要是由于幾何改善而不是膠原各向異性（c）。圓周方向的應(yīng)變在兩種閥門設(shè)計之間是可比的。
全尺寸圖像從我們第一次在綿羊中植入DTEHV的長期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)開始，我們觀察到小葉與壁融合，這導(dǎo)致隨著時間的推移瓣膜功能不全的發(fā)展。6，30 根據(jù)計算模擬，假設(shè)必須調(diào)整原始的DTEHV幾何形狀，以便在徑向方向上擴(kuò)展傳單，而不是壓縮。因此，開發(fā)了一種生物反應(yīng)器插入物，以在培養(yǎng)過程中施加所需的瓣膜幾何形狀，該幾何形狀在去細(xì)胞化和去除插入物后保持。這導(dǎo)致DTEHV具有增加的配合面積和顯著的徑向和圓周腹部曲率。
通過引入約束插入物來調(diào)整生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的培養(yǎng)條件可能通過限制營養(yǎng)和氧交換而影響了組織的形成。然而，這些DTEHV似乎仍然在整個小葉厚度中含有均勻的ECM分布，主要由膠原蛋白組成。這些組織學(xué)發(fā)現(xiàn)與先前培養(yǎng)的基于人類細(xì)胞的TEHV一致，該TEHV具有原始的閥門幾何形狀，而沒有插入物。17
此外，引入插入物會進(jìn)一步影響全局膠原蛋白的方向。在組織培養(yǎng)過程中，已知無紡布PGA網(wǎng)格會水解，從而失去其機(jī)械完整性和結(jié)構(gòu)支撐。9，19，23 這種降解曲線與細(xì)胞施加的張力相結(jié)合，導(dǎo)致組織在無約束方向上壓實(shí)，從而導(dǎo)致沿約束方向的膠原取向。4，18
在這項(xiàng)研究中，使用針對剛性物體的組織壓實(shí)來根據(jù)生物反應(yīng)器插入物的形狀施加DTEHV幾何形狀。培養(yǎng)2周后，支架失去其機(jī)械完整性，組織開始致密。29 在壓實(shí)時，小葉組織受到剛性生物反應(yīng)器插入物的約束，但小葉游離邊緣的組織在徑向方向上仍可能略微壓實(shí)。這導(dǎo)致在凝固區(qū)域主要是圓周對齊的膠原蛋白，并且更隨機(jī)地分布在腹部底部。
其他使用約束方法來控制DTEHV幾何形狀的研究很有希望，但是到目前為止還沒有報道高達(dá)1200萬次循環(huán)的長期功能。18，24–26，28 本研究中產(chǎn)生的DTEHV在反流、心輸出量和打開和關(guān)閉行為方面顯示出長達(dá)16周的體內(nèi)模擬的令人滿意的長期功能，只有一個瓣膜在400萬次循環(huán)后失效，無法在疲勞測試期間適應(yīng)和穩(wěn)定施加的肺壓條件。從先前在綿羊和非人靈長類動物中的體內(nèi)植入研究中，在5小時內(nèi)觀察到宿主細(xì)胞再繁殖，伴有8周后細(xì)胞外基質(zhì)的變化，并有證據(jù)表明這些細(xì)胞產(chǎn)生ECM。6，30 因此，本研究中開發(fā)的DTEHV在生理性肺條件下應(yīng)具有足夠的抗疲勞性，以便為宿主細(xì)胞重新填充和維持ECM提供足夠的時間。
除了在大的共置面積和增強(qiáng)的腹部曲率方面改善瓣膜幾何形狀外，膠原各向異性對于在動態(tài)加載期間獲得徑向小葉拉伸至關(guān)重要，這是天然小葉的特征，2由于菌株誘導(dǎo)的膠原重組而導(dǎo)致體內(nèi)植入后的各向異性進(jìn)一步增加。4 與報告的剛度值相比，1人本體主動脈瓣瓣小葉在徑向和周向的切向模量分別為約2.0±1.5和15.6±6.4 MPa。報告的徑向DTEHV的切向模量與2.5±0.7 MPa相當(dāng)，但在圓周方向上較低，為3.6±1.0 MPa。
盡管局部觀察到的膠原各向異性差異沒有實(shí)現(xiàn)到模型中，但這些計算模擬表明，整體膠原各向異性的額外效應(yīng)似乎不會影響肺負(fù)荷條件下的組織負(fù)荷行為。因此，僅實(shí)施的幾何改進(jìn)就足以防止整個瓣膜幾乎*受到徑向組織壓迫。
使用DTEHV進(jìn)行人類應(yīng)用的概念在再生能力和增長潛力方面仍然有很大的希望，這將克服對年輕患者進(jìn)行多次再干預(yù)的必要性。不需要使用自體細(xì)胞，可以使用異體細(xì)胞來簡化法規(guī)并允許現(xiàn)成的可用性。進(jìn)一步開發(fā)適用于微創(chuàng)心臟瓣膜植入的生物降解支架應(yīng)成為未來研究的重點(diǎn)，以完成生長瓣膜概念。
總之，本研究提出了一種成功的解決方案，通過在培養(yǎng)過程中使用約束性生物反應(yīng)器插入物來施加所需的三維彎曲組織工程瓣膜幾何形狀，從而允許在去細(xì)胞化和去除插入片段后保持形狀。這導(dǎo)致了*有能力的現(xiàn)成的基于人類細(xì)胞的DTEHV，具有較大的共置面積和深刻的腹部曲率。長期功能主要維持長達(dá)16周的體內(nèi)模擬，為宿主細(xì)胞的再繁殖留出了足夠的時間。使用生物反應(yīng)器插入物導(dǎo)致均勻分布的組織形成，共適區(qū)域的圓周膠原取向以及整個小葉組織各向異性。基于力學(xué)數(shù)據(jù)，我們的計算模型顯示，通過獲得的幾何調(diào)整，橈骨組織壓縮顯著降低。因此，這些改善的DTEHV預(yù)計不易發(fā)生宿主細(xì)胞介導(dǎo)的小葉縮回，并且在植入后仍將保持能力。
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