輕松測試組織和細胞的機械性能！
Optics11結合*Piuma技術基礎上開發設計出了結構緊湊靈活的PIUMA Chiaro。這種納米壓痕模塊可以放置在任何顯微鏡，允許在最小的樣品或者特征上進行非常精確的壓痕實驗。單細胞壓痕實驗終于被變得非常簡單了！該系統在液體中表現特別好。只要插入探頭就可以開始壓痕測試！Chiaro人體組織和軟材料的機械性能Chiaro人體組織和軟材料的機械性能
Chiaro細胞壓痕儀
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題目：基體剛度對梗死邊界機械耦合和力傳播的影響
（如果需要完整文獻請與我們工作人員聯系，可試樣）
簡介：異質細胞間耦合在心臟的機械和電信號傳輸中起著重要作用。盡管許多研究已經研究了心肌組織內肌細胞和非肌細胞之間的電信號傳導，但研究機械對應物的研究并不多。本研究旨在研究在健康和心臟病發作模擬基質僵硬條件下，底物硬度和心肌成纖維細胞（CMF）的存在對心肌細胞（CMs）和CMFs機械力傳播的影響。使用集成了與 CMF 集成的生物納米壓痕儀測量了 CM 產生的收縮力及其在 CMF 中的傳播熒光顯微鏡用于快速鈣成像。我們的結果表明，較軟的基質有助于更強和更進一步的信號傳輸。有趣的是，CMF的存在以剛度依賴的方式衰減了信號傳播。與具有CMF的軟基質相比，存在CMF的較硬基質使信號衰減約24-32%，表明心肌梗死后基質剛度增加和CMF數量增加對心肌功能具有協同不利影響。此外，CMF運動在CM-CMF邊界處的跳動模式也取決于基板剛度，從而影響CM產生的收縮力的傳播波形。我們進行了計算機模擬，以進一步了解不同力傳遞模式的發生，并表明在CM-CMF界面處組裝的細胞-基質粘附（根據基板剛度而不同）在決定信號傳輸的效率和機制方面起著重要作用。總之，除了底物剛度外，受底物剛度影響的細胞-細胞和細胞-基質相互作用的程度和類型也會影響心肌組織中肌細胞和非肌細胞之間的機械信號傳導。
1.介紹
心肌梗塞（MI）是死亡的主要原因之一）。MI導致心肌中疤痕組織的形成，與健康組織相比，心肌具有不同的機械性能和細胞組成（）。具體來說，梗死組織已經顯示出更硬，測量的剛度為100-1000 kPa（，），而健康組織的硬度僅為～10-20 kPa（）。在健康的心臟組織中，心臟成纖維細胞（CFs）占心肌細胞的～45-75%，取決于物種（）。成年哺乳動物心臟的再生能力有限。在像心肌梗死這樣的損傷后，丟失的心肌細胞（CM）被纖維化疤痕組織）所取代，該組織主要由損傷區域附近的CF形成。在此過程中，CF轉分化為心肌成纖維細胞（CMF），并構成疤痕組織細胞群的重要組成部分。疤痕組織的形成觸發周圍心肌（重塑）。早期的研究表明，纖維化引起的僵硬增加可歸因于膠原細胞外基質（ECM）的過度積累和交聯）。總的來說，CMF介導的纖維化組織形成，基質硬度增加和CMF數量增加會損害心臟收縮力和功能。因此，更好地了解CM和CMF之間的結構和功能相互作用以及機械微環境對這種相互作用的影響對于開發新的心臟療法是必要的。
各種研究表明基質硬度，外部機械刺激和CMF的存在對心臟收縮力（的影響）。ECM硬度的增加也被證明會影響CM分化和成熟。然而，大多數這些早期研究都集中在CMs和CFs之間關于底物剛度的電滲耦合或研究傳導速度的變化，以響應非肌細胞（即CFs或CMF）群體的增加（）。除了電滲耦合，機械耦合在確定心肌細胞（信號傳播的效率方面也起著重要作用。然而，關于機械信號在CM-CMF邊界上的傳播以及基板剛度對機械傳播距離的影響的文獻仍然有限。最近的研究很少調查外部機械刺激對CMs（產生的收縮力的影響。盡管這些研究研究了機械微環境對CM收縮性和CM-CM耦合的影響，但據我們所知，這些研究都沒有研究CMF中收縮力傳播的大小和距離。
本研究通過CMs和CMFs在不同剛度基質上的微模式共培養，模擬健康和梗死心肌，并研究了CM-CMF界面上CMF之間的機械信號傳播。為此，我們制造了具有14、83和484 kPa剛度的底物，以模擬健康（15 kPa）（6），1周（50-100 kPa））和2至周（200-1000 kPa）（）MI梗死后組織，分別使用生物相容性彈性聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）。為了研究CMF的存在對機械信號傳播的影響，我們在微圖案襯底上接種了含有約30%CFs（23）的CM懸浮液混合物，并通過CFs的自增殖和分化為CMF形成CM-CMF邊界。 通過駐留測量在單細胞水平上測量CMs和CMF的收縮力（14， 24）使用生物納米壓痕（）。 這里使用的停留測量方法類似于用于測量細胞應力松弛行為的技術（27）。簡而言之，將細胞壓痕到一定程度，并且壓痕探頭與細胞保持接觸30秒。跳動引起的電池高度變化導致懸臂偏轉的變化，這對應于電池沿橫向施加的收縮力。使用停留測量方法，我們已經表明心肌的微環境特性，如基質硬度和CMF的存在，在調節跨MI邊界的機械傳導中起著關鍵作用。研究了CMs和CMFs收縮力的大小和模式，闡明了梗死組織中機械信號傳播的機制。除了機械表征外，我們還對細胞-細胞偶聯蛋白和粘附進行了生化分析。CMF通過其應激纖維中α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達來鑒定（）。最后，我們使用有限元分析（FEA）模型來理解和驗證我們的實驗結果。有趣的是，我們發現CMF的存在會根據基板剛度衰減機械信號。此外，我們還發現CM-CMF界面處的細胞-基質粘附分布控制著CM-CMF邊界處的跳動波型。了解組織微環境對常駐心肌細胞的影響是改善心肌治療的關鍵一步。這項研究的結果對于理解CMF的存在和ECM硬度對健康和梗塞心臟的細胞相互作用和功能的影響可能很重要。
采用不同比例的堿/固化劑制備不同剛度的PDMS基底，研究基質剛度對細胞功能和行為的影響。我們分別使用1：100、1：40和1：20堿/固化劑比例組合制備了三種不同的基材，其剛度約為14 kPa（軟）、83 kPa（中等）和484 kPa（剛性）。準備好混合物后，將它們脫氣并倒在普通玻璃蓋玻片（直徑= 30 mm）上，以750 rpm旋轉30秒，然后烘烤。1：40和1：20 PDMS樣品分別在80°C下烘烤5和2 h，而1：100 PDMS樣品在95°C下烘烤13–14 h以固化。固化后，使用惰性硅膠將PDMS涂層玻璃基板粘合到35-mm培養皿上，以防止樣品在納米壓痕儀測量期間移動，用等離子體放電處理1分鐘并浸入去離子水中直至基板功能化。
在本研究中，制備了以下兩組樣品：共培養樣品（即CM-CMF）和不含任何CMF的對照樣品（即單個CM培養物）。對于這兩種樣品，在細胞接種前用FN涂覆底物，以促進細胞附著在PDMS底物上。將FN溶液（50 μ g/mL）以液滴形式置于底物中心，并將樣品在37°C下孵育1 h。蛋白質孵育后，除去溶液，洗滌樣品并保持在PBS中直至細胞接種。在共培養樣品中，為了在基板上形成細胞附著的圖案，如前所述，使用厚度為100 μm的PDMS薄膜薄條在細胞接種期間部分阻斷細胞培養底物（圖1 A）。去除條帶后，CF細胞增殖，遷移并在涂層表面的另一半分化為CMF。對于對照樣品，我們將PDMS條帶放在基板上，然后用FN涂覆，并將其留在整個細胞培養物中，以防止細胞遷移和基質另一半的生長。將PDMS條帶放置在FN包被之前有助于條帶更牢固地粘附在基材上，并防止在更換培養基期間出現任何脫落，直到我們在細胞培養的第5天，即駐留測量之前剝離條帶。
使用Piuma Chiaro納米壓痕系統（Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）（26）測試天然心臟組織塊，具有不同剛度的PDMS底物以及PDMS底物上培養的CMF細胞的硬度。
使用直徑為90 μm的膠體探針測試具有不同剛度的PDMS基板。用于軟基板的壓痕探頭的彈簧常數為0.43 N/m，而用于中等和剛性基板的探頭的彈簧常數為4.21 N/m。針對每個PDMS底物條件測試了三個單獨的樣品，并從每個樣品的不同位置記錄了多個測量值。所有樣品共記錄了204-390個壓痕數據點。
用于在PDMS襯底上接種的CMF的壓痕探頭的彈簧常數和直徑分別約為0.045 N / m和41 μm。針對每種底物類型，在兩個獨立樣品上總共測試了45種不同的CMF細胞。在測試之前，懸臂的靈敏度校準是通過壓痕硬表面（即載玻片）進行的。使用的加載速度分別為 50、2 和 0.2 μm/s。開發了一個定制的MATLAB代碼（The MathWorks，Natick，MA），以確定探針和樣品之間的接觸點，并使用赫茲接觸模型（27，33）識別樣品的楊氏模量：
其中F是施加的力，δ是壓痕深度，R是膠體探針的半徑，E是樣品的楊氏模量。假設樣品是不可壓縮的（即泊松比為0.5），因為使用該模型的文獻研究得出的結論是，當泊松比從0.3到0.5變化時，測量的性質變化小于20%，因此，假設大多數生物樣品的不可壓縮性是合理的).使用單因素方差分析進行統計，以95%置信水平報告統計學意義（p < 0.05）。
通過駐留實驗用納米壓痕儀測量細胞片內單個CM和CMF的收縮力。簡而言之，將納米壓痕探針與樣品接觸，并且探針的位移保持恒定（換句話說，探針駐留在樣品上）30秒以動態測量其偏轉，這與電池沿橫向相對于基板的收縮力成正比。
首先，我們測量了共培養樣品上與CM-CMF邊界相鄰的單個CM的收縮力，以及沒有任何CMF的對照樣品上CM-PDMS邊界處的CM。然后，依次測量單個CMF的收縮力，每次在距邊界更遠的距離處測量，如圖 A所示，直到沒有可檢測到的信號。所有跳動力測量均在細胞核上進行，以確保一致性，并盡量減少細胞剛度異質性的影響。每次測量后，懸臂沿X軸移動，并在最近的CMF上進行測量。因此，所有測量都是在距邊界相似的距離處進行的，根據最近CMF的確切位置，差異僅為～5-10%。所用探頭的彈簧常數和直徑分別為0.067 N/m和5.4 μm。開發了定制的 MATLAB 代碼來分離每個單拍并計算平均收縮力。
為了開發本研究中的FEA模型，通過圖像分析和納米壓痕測量測量了CMF的尺寸（即細胞直徑和高度）。首先，我們通過測量新附著的球形CMF的直徑和高度來計算單個CMF的體積，該CMF在細胞接種后不超過15分鐘接種在培養皿上，以確保細胞仍呈球形。簡而言之，捕獲了這些球形細胞的明場圖像，并通過使用ImageJ繪制兩條從細胞中心穿過的對角線來測量直徑，以獲得D0.然后，這些球形細胞的高度，H0，通過使用納米壓痕儀壓進細胞及其旁邊的基板并記錄細胞-基底接觸點（）來測量。這些尺寸用于計算細胞的體積V0如下：
最后，我們測量了在不同剛度基材上播種并鋪展的CMF的高度。由于擴散的CMF的不規則形狀，我們假設細胞體積被保留，而不管細胞的形狀調制，同時擴散（）。基于這一假設并使用第V卷0并測量了不同剛度基板上展開的CMF的CMF高度H，我們使用以下公式計算了不同PDMS基板上CMF的直徑D：
首先，我們通過納米壓痕實驗研究了天然組織基質、具有不同剛度的制備PDMS底物以及在這些基質上接種的CMFs的粘彈性。我們觀察到不同PDMS基板的測量剛度的變化取決于壓痕的加載速度。PDMS基板剛度是在三種不同的加載速度（即50、2和0.2 μm/s）下測量的，如圖B所示。當加載速度從50 m/s降低到2 μ m/s和從2 μm/s（p < 0.0001）降低時，基體的剛度顯著降低，但軟基體的剛度從50 m/s降低到2 μm/s（p = 0.1484）時除外。同樣，在不同PDMS襯底上晶種的CMF表現出加載速度依賴性剛度（p < 0.005），但當加載速度從2 m/s降低到0.2 μ m/s（p = 0.1924）時，在中等襯底上接種的CMF除外（C）。為了進行比較，測量了天然大鼠心臟組織的硬度，該硬度也隨著加載速度從50降低到0.2 μm / s（p < 0.05）而降低。
PDMS襯底和在PDMS襯底上晶種的CMF均表現出應變速率依賴性剛度。軟底物剛度約為13.9-17.66 kPa，與天然健康心臟組織的硬度相似（即11.33-18.46 kPa （）），因為我們測量的健康成年大鼠心臟為13.32±8.60 kPa，而中度和僵硬底物的硬度分別為83.29-105.71和483.92-529.63 kPa，與早期研究中測量的梗死心臟組織的硬度相當（）. 同樣，在軟、中和硬基底上接種的 CMF 的剛度分別為 0.95–3.02、2.06–4.96 和 1.61–5.47 kPa。可以看出，正如預期的那樣，電池剛度隨著基板剛度的增加而增加（）。這種加載速度依賴性剛度與先前在組織和細胞（上的發現一致）。
為了區分共培養樣品中的CM和CMF并正確識別CM-CMF邊界，用Ca對樣品進行染色2+染。來自CA的代表截圖2+硬質基板樣品上的通量視頻（）如圖所示。因為只有 CM 表現出 Ca（鈣）2+通量，用于在活細胞測量期間實時區分兩種細胞類型（圖2 A）。我們還開發了一個定制的 MATLAB 代碼來測量這些鈣的瞬時持續時間2+助焊劑視頻。對于接種在軟、中和硬基質上的CMs，結果分別為1.00 ± 0.59、1.17 ± 0.49和2.10 ± 0.37 s。基于Ca的代表性CT曲線2+在不同剛度基板上培養的CM的成像如圖2D所示。
在這項工作中，我們研究了機械微環境對肌細胞（即CMs）在非肌細胞（即CMF）上的機械信號傳播的影響。我們研究了機械耦合以及CM和CMF之間的相互作用在健康和梗死組織模型中的關鍵作用。據我們所知，我們的研究測量和表征了CM和CMF的收縮力，CM-CMF邊界處的力傳遞及其對基體剛度的依賴性。我們已經證明，較軟的基板有助于更強的收縮和機械信號的傳輸。此外，我們發現CMF的跳動模式取決于基質剛度，在機械信號傳輸中起著重要作用，這是一個有趣的發現，可能有助于闡明梗死組織硬度和大小對心律失常的影響。我們還確定了粘附的剛度依賴性分布對機械信號傳輸的作用。該項目的結果將幫助我們更好地了解疤痕組織的影響，這將有助于探索梗塞和心律失常等心肌病的新療法。
Optics11結合*Piuma技術基礎上開發設計出了結構緊湊靈活的PIUMA Chiaro。這種納米壓痕模塊可以放置在任何顯微鏡，允許在最小的樣品或者特征上進行非常精確的壓痕實驗。單細胞壓痕實驗終于被變得非常簡單了！該系統在液體中表現特別好。只要插入探頭就可以開始壓痕測試！Chiaro人體組織和軟材料的機械性能Chiaro人體組織和軟材料的機械性能
Chiaro細胞壓痕儀
Piuma Chiaro和Piuma獨立機型使用同樣的技術以及硬件。這意味著兩者的掃描頭部可以互換，在保持其他所有硬件和軟件不變的情況下。 Piuma 納米壓痕技術包括了一個非常敏感的探測壓頭，一個可以粗進以及精進的移動臺，通過它可以實現樣品的自動逼近以及非常精確的壓痕。壓頭可以在X-Y方向移動,允許在單個細胞上進行精密的點陣壓痕來測量楊氏模量。Piuma Chiaro可以和任何類型顯微鏡結合使用！
楊氏模量
10 Pa – 1 GPa
可重復性
<1%
壓頭尺寸
100 nm to 100's µm
最大壓痕深度
20 µm
壓痕動態帶寬
~ DC 100 Hz (continuous)
力學分辨率
0.1 nN
機械臂移動范圍
12 x 12 x 12 mm2
M最小點陣間距
<1 µm
點陣壓痕速度
Up to 1 point / s
