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1. 簡介
Runx2（Runt相關轉錄因子2早期稱為核心結合因子α-1（Cbfa1））是間充質干細胞（MSCs）成骨細胞分化和骨形成的重要轉錄因子。在 Runx2 中具有純合突變的小鼠表現出胚胎牙齒發(fā)育停滯，由于缺乏成骨細胞分化而沒有膜內和軟骨內骨化，并且是胚胎致命的。Runx2 被體內小鼠皮質骨中的流體剪切應力激活，據報道拉伸和流體剪切應力等機械應力可增強成骨細胞中 Runx2 的表達并促進其在體外成骨細胞分化。這些發(fā)現表明，Runx2調節(jié)成骨細胞中的機械轉導以形成骨。然而，Runx2在機械應力誘導的骨形成中的生物學功能的潛在機制尚未闡明。
在本研究中，我們研究了Runx2在機械拉伸誘導骨重塑中的功能，通過在Runx2中對牙齒施加正畸力+/?小鼠，CCD的動物模型。我們研究了Runx2中的增殖和成骨細胞分化+/?實驗牙齒運動的張力側小鼠，以及源自Runx2的拉伸BMSC中的小鼠+/?小 鼠。最后，我們研究了mTORC2在Runx2中BMSC的機械拉伸誘導增殖和成骨細胞分化中的激活+/?小 鼠。
2. 材料和方法
2.7. 細胞培養(yǎng)
后，股骨和脛骨為6-9周齡野生型和Runx2+/?仔細清除小鼠貼壁軟組織中的細胞并收獲骨髓細胞。收集的細胞以4×10的密度接種7每3.5厘米組織培養(yǎng)的細胞并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)：Dulbecco的改良Eagle中低葡萄糖含有10%熱滅活胎牛血清和青霉素/鏈霉素，在 37 °C 的 5% CO 中2 大氣層。培養(yǎng)4天后，去除非貼壁細胞，再培養(yǎng)貼壁細胞3天，直到90%匯合，在本研究中用作BMSC。為了促進成骨，BMSCs在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)：補充有10nM地塞米松（Sigma），82μg/ ml l-抗壞血酸（Wako）和10mM β-甘油磷酸鹽（Sigma）的生長培養(yǎng)基，在37°C的5%CO2大氣層。每三天更換一次成骨培養(yǎng)基。
2.8. 機械拉伸在細胞上的應用
BMSCs在10厘米上播種在細胞拉伸腔室，涂有0.05mg / ml纖連蛋白（Sigma）并以12×1的密度培養(yǎng)10小時5細胞/厘米2.在細胞達到亞匯合后，使用專門設計的裝置拉伸它們，該裝置使腔室寬度單軸增加12%。拉伸值是根據拉伸誘導的BMSC增殖數據確定的。在使用抑制劑的情況下，在與抑制劑孵育1小時后拉伸細胞。未拉伸的細胞在相同條件下孵育并用作對照。
3. 結果
3.3. 拉伸對野生型和Runx2中BMSC增殖的影響+/?小 鼠
在牙齒運動的張力側，PDL中招募的MSC在牙槽骨表面迅速增殖，并啟動成骨細胞的分化（Pavlin和Gluhak-Heinrich，2001）。 然后發(fā)生細胞外基質的礦化并促進骨形成（Pavlin和Gluhak-Heinrich，2001）。闡明Runx2中牙齒運動張力側骨形成減少的機制+/?小鼠，我們拉伸小鼠BMSC并在體外檢查拉伸誘導的成骨細胞功能。我們檢查了野生型和Runx2中的DNA含量+/?拉伸后的BMSCs評估Runx2是否與成骨細胞譜系細胞的增殖有關。未拉伸（對照）野生型和Runx2中的DNA含量+/?BMSC增加并在機械負荷開始后48小時達到峰值（圖4A）。卸載野生型和Runx2之間的DNA含量沒有顯著差異+/?BMSC從0到48小時（圖4A）。在野生型BMSC中，機械刺激在拉伸12和24小時時顯著增加了DNA含量，在24小時達到峰值（圖4A）。同時，來自Runx2的DNA含量+/?BMSC在12和24小時拉伸顯著增加，并在36小時觀察到峰值（圖4A）。Runx2+/?與野生型BMSC相比，BMSC在24 h時表現出顯著降低拉伸誘導的DNA含量增加，而拉伸野生型和Runx2+/?BMSC在12、36和48小時沒有差異（圖4A）。此外，我們使用CCK-8進一步定量評估了BMSC的細胞增殖。在機械負荷開始2小時后，機械拉伸增加了野生型和Runx<>的增殖+/?BMSC，更重要的是拉伸的Runx2+/?與野生型BMSC相比，BMSC顯著增殖。
細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（cdks）是驅動細胞周期的生長因子介導信號的整合因子（Baldin等人，1993;林和卡爾迪斯，2013 年）。生長因子促進細胞周期的G1期，D型細胞周期蛋白主要作為生長因子傳感器（Baldin等人，1993;林和卡爾迪斯，2013 年）。p21和p27是細胞周期蛋白D-cdk4復合物的緊密結合抑制劑并抑制G1進展（Harper等人，1993;波利亞克等人，1994年）。我們評估了細胞周期調節(jié)蛋白在野生型和Runx2中的表達+/?在拉伸開始后6和12小時BMSC檢查細胞周期進程與拉伸的關聯(lián)。細胞周期蛋白D在未拉伸的野生型和Runx2中得到增強+/?BMSC在12小時與0小時相比（圖4B）。拉伸在野生型BMSC中6小時和Runx2中顯著誘導的周期蛋白D+/?12小時的BMSCs（圖4B）。 p21蛋白在未拉伸的野生型和Runx2中的表達+/?BMSCs從0到6小時沒有變化，但從6小時減少到12小時，盡管Runx2+/?無論機械負荷如何，BMSC在21至0 h期間的p12表達都明顯高于野生型BMSC（圖4B）。在野生型BMSC中，拉伸減弱p21在6小時時表達，但在12小時時不表達，而在Runx2+/?BMSC，在21和6小時拉伸減弱p12表達（圖4B）。從27到0小時，BMSCs中p12表達幾乎沒有差異，無論負載和Runx2基因劑量如何（圖4B）。
這些發(fā)現表明，拉伸增加了BMSC的增殖并調節(jié)了細胞周期進程，而Runx2基因劑量的減少延遲了機械刺激誘導的BMSCs增殖。
3.4. 拉伸對野生型和 Runx2 BMSC 成骨的影響+/?小 鼠
接下來，我們將拉伸加載到野生類型和 Runx2 上+/?成骨培養(yǎng)基中的BMSCs，研究Runx2對牽伸誘導的成骨細胞分化的影響。在未拉伸的野生型和 Runx2+/?BMSCs，ALP活性，一種早期成骨標志物，在拉伸開始后0至21天逐漸增加，此后下降，直到第28天，兩種基因型之間沒有顯著差異（圖4C）。在野生型BMSC中，拉伸在第7天和第14天顯著增加了ALP活性，并且在第7天ALP活性達到峰值（圖4C）。在 Runx2 中+/?BMSC，機械刺激在第14天顯著增強了ALP活性，但在第7天沒有，并且在第21天觀察到ALP活性的峰值。此外，雜合子Runx2缺乏癥在第14天顯著降低了BMSC中拉伸誘導的ALP活性（圖4C）。拉伸誘導的 Runx2 中 ALP 活性峰值+/?BMSC顯著低于野生型BMSCs（圖4C）。
機械負荷在拉伸開始后第14天顯著增加了野生型BMSC中的OSC mRNA表達，拉伸誘導的OSC mRNA表達在第21天達到峰值，此后下降（圖4D）。相反，拉伸顯著誘導了Runx2中的OSC mRNA表達+/?BMSC在第21天，但不在第14天（圖4D）。Runx2+/?BMSC的拉伸誘導OSC mRNA表達峰明顯低于野生型BMSCs（圖4D）。
我們進一步研究了拉伸誘導的基質沉積鈣，這是成骨的晚期標志物，在野生型和Runx2的BMSC中+/?小鼠（圖4E）。在卸載的百搭型和 Runx2 中+/?BMSCs，鈣含量持續(xù)增加，直到拉伸開始后第28天，但野生型和Runx2之間沒有顯著差異+/? (圖4機械負荷在第21天和第28天以及Runx2中顯著提高了野生型BMSC的鈣含量。+/?BMSC在第28天，但不在第21天（圖4E）。第28天，Runx2中拉伸誘導的鈣含量+/?BMSC明顯低于野生型BMSC（圖4E）。
此外，野生型和Runx2+/?BMSC在機械刺激開始后第7天染色ALP，第21天染色茜素紅（圖4F和G）。拉伸導致兩種基因型的ALP和茜素紅色顯著染色（圖4F和G）。未拉伸和拉伸的 Runx2+/?BMSC的染色率低于相應的野生型BMSC（圖4F和G）。
綜上所述，我們發(fā)現拉伸增強了野生型和Runx2的成骨作用。+/?BMSC，但 Runx2+/?與野生型BMSC相比，BMSCs顯示出拉伸誘導的成骨細胞分化減少和延遲。
3.5. 肺泡骨張力側成骨細胞中的 mTOR 和 Rictor 蛋白表達
評估m(xù)TORC2與Runx2中牙齒運動延遲張力側骨形成的相關性+/?小鼠，我們在實驗牙齒運動的張力側檢查了成骨細胞中mTOR和Rictor的蛋白質表達。
在開始實驗牙齒移動之前（第0天），mTOR和Rictor在PDL中以野生型和Runx2表達+/?老鼠，雖然 Runx2+/?與野生型同窩小鼠相比，小鼠表現出兩種蛋白質的表達較弱（圖5H，N，h和n，箭頭）。在實驗性牙齒運動的第1天和第3天，在野生型小鼠實驗牙齒運動的張力側檢測到成骨細胞中mTOR和Rictor表達增強（圖5J，P，L和R，箭頭），而Runx2+/?小鼠在第3天表現出這些蛋白質的較弱表達（圖5j，p，l和r，箭頭）。在Runx2成骨細胞中未檢測到mTOR和Rictor的表達+/?第1天的小鼠（圖5i，j，o和p）。我們在牙齒運動開始后的第3天使用野生型小鼠作為陰性對照，并且沒有表達（數據未顯示）。
5. 結論
我們證明了Runx2中的牙齒移動延遲+/?小鼠與野生型小鼠的比較。這促使我們使用 Runx2+/?小鼠作為RUNX2CCD患者延遲正畸牙齒運動的模型+/?.此外，我們還展示了 Runx2+/?BMSCs減少拉伸誘導的增殖，并通過mTORC2激活分化為成骨細胞。我們的研究結果表明，Runx2與mTORC2 / Akt激活的關聯(lián)是牙齒運動過程中拉伸誘導的成骨細胞增殖和分化的關鍵作用之一。
技術背景：
當前細胞基礎研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主，這種平面培養(yǎng)與實際“動態(tài)+立體"模式差別很大，導致細胞形態(tài)學、細胞分化、細胞間相互作用與體內動態(tài)環(huán)境產生明顯差異。比如細胞骨架重組、細胞形態(tài)以及基因蛋白表達改變等。
●動物實驗前更可靠的評估
●干細胞分化機制
●機械刺激力與癌癥的相關性
●生醫(yī)材料與細胞動態(tài)特性研究
●體外疾病微環(huán)境的快速建立
CELL TANK為細胞和組織模型提供機械拉伸條件的平臺。
CELL TANK為細胞牽張系統(tǒng)使科學家能夠輕松而精確地將仿生機械應變應用于細胞和組織。國產細胞循環(huán)拉伸設備國產細胞循環(huán)拉伸設備
拉伸腔體共有三款 分別為32*32mm；20*20mm；10*10mm
細胞應力加載培養(yǎng)系統(tǒng)
2. 細胞增殖后，選擇拉伸模式并開始循環(huán)刺激。
3. 根據實驗目標收獲/處理細胞，分析數據。
· 均勻負載
培養(yǎng)腔室采用預埋橫桿技術，保證每個細胞都沿著拉伸軸均勻地承受應變，非軸向方向上的次級載荷極低
· 高再現性
高精度步進電機保證在各種速度和拉伸比組合中實現一致的運動程序，機械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結合，保證高度可重復的力學刺激
· 一體式控制
自帶觸摸控制屏，無需電腦。內置ARM芯片，高效穩(wěn)定運行的同時簡單易用
· 多樣的拉伸模式
靈活配置不同牽張加載周期、大小、頻率、持續(xù)時間，靜態(tài)保持、正弦波形、三角波形、矩形以及各種特制波形
· 高通量培養(yǎng)腔室
有效拉伸面積32×32mm，PDMS材質基底適配各種實驗室分析技術，包括細胞固定和熒光成像等
| 外形尺寸 350x330x110 mm | |
| 主機重量 3 kg | |
| 拉伸腔體 4個，32x32 mm / 8個，20x20 mm | |
| 控制模式 三角波、正弦波、方波及其組合 | |
| 最大應變率 30% | |
| 最高拉伸速率 30 mm/s | |
| 最高循環(huán)頻率 2 Hz | |
| 基底膜厚度 0.2 mm | |
| 使用環(huán)境 CO2培養(yǎng)箱 |
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